酶底物法检测粪便中大肠菌群的原理及操作流程

摘要：在地表水中水质环境监测粪大肠菌群具有重要的作用。而酶底物法检测粪大肠菌群具有较准确、速度快、操作简单等特点，是一项新的技术。

1、方法原理

在特定温度下培养特定的时间, 粪大肠菌群能产生酶底物法采用大肠菌群细菌能产生β-半乳糖苷酶, 将选择性培养基中的无色底物邻硝基苯β-D-吡喃半乳甘糖分解黄色的邻硝基苯酚, 在紫外灯照射下产生荧光。统计阳性反应出现的数量, 查MPN图表, 在将其计算出样品中粪大肠菌群的浓度值。其酶底物法检出限是10MPN/L。

2、实验室用水

实验室用水为无菌水, 取来适量的纯净水, 放在烧杯中, 经过121摄氏度, 高压蒸汽灭菌, 需要20分钟。

3、采样瓶的清洗准备

(1) 是新购买的500ml具旋帽或者是磨口塞得广口玻璃瓶, 应在百分之二的盐酸中浸泡几个小时, 还需要用自来水冲洗干净, 再用纯净水清洗1-2次, 控干, 备用。

(2) 将清洗干净干燥的采样器, 用专用的纸包裹起来, 放入恒温干燥箱内, 将温度设置到121摄氏度, 灭菌20分钟, 烘干。灭菌完成后, 还需要关闭实验室电源待温度降到50摄氏度以下时, 方可开门取样品瓶, 不然, 玻璃瓶会因为操作不当爆裂。

4、样品的采集及保存

(1) 单独采样, 优先采样。使用已经准备好的采样瓶, 采样。在采样的过程中产样瓶不用再进行冲洗。

(2) 在同一采样点进行分层采样时, 应自上而下进行采样, 以免不同层次的搅扰。

(3) 水样的保存条件及时间:水样应在10摄氏度以下冷藏保存;应尽快分析, 最长时间不能超过6个小时。

(4) 化验员接样后, 不能立即检测, 应将样品与4摄氏度以下冷藏并在2小时内检测。

5、分析样品

5.1、样品稀释

需要根据样品污染程度确定接种量, 避免接种样品培养后97孔定量盘出现全部阳性或全部阴性。在接种量小于100ml的时候, 应稀释样品后再进行接种试验, 接种量为10ml的时候, 取10ml样品加入到90ml无菌水的三角瓶中混合均匀制成1:10的稀释样品, 其他接种量的稀释样品依次类推。在未知样品, 可选用多个接种量进行检测。

5.2、接种

量取100ml样品或是稀释样品与灭菌后的三角瓶, 再加入2.7克+-0.5克培养基粉末, 在充分搅拌混匀, 等完全溶解, 在将其全部倒入97孔定量盘内, 以手扶平97孔定量盘背面, 赶出孔内气泡, 然后, 用程控定量封口机封口。观察97孔定量盘颜色, 若出现类似或者深于标准阳性比色盘的颜色, 则还需要进行样品排查、培养基无菌水等一系列因素后, 终止实验或重新实验。

5.3、培养

测定粪大肠菌群时, 将封口后的97孔定量盘, 放入恒温培养箱中, 在44.5摄氏度+-0.5摄氏度下, 培养24小时。

5.4、对照实验

(1) 空白对照

每次实验都要用无菌水按照分析步骤进行实验室空白测定。培养后的97孔定量盘不得有任何颜色, 不然, 该实验失败, 应重新测定。

(2) 阳性与阴性对照

将粪大肠菌群标准菌株制成300-3000个/ml的菌悬液, 将菌悬液按接种和培养要求操作, 阳性菌株应呈现阳性反应;阴性菌株应呈现阴性反应;否则, 结果无效, 实验失败, 重新测定。

(3) 结果判读及计数和有效位数的要求

将培养24小时的97孔定量盘进行结果读数, 样品出现变黄色判断为粪大肠菌群阳性。测定结果保留2位有效数字。

5.5、结果计算与表示

从97孔定量盘法MPN表中查的每100ml水样中粪大肠菌群的MPN值, 在根据样品稀释度不同, 按照公式换算样品中粪大肠菌群浓度。

结语

本文通过对粪大肠菌群检测方法酶底物法以其操作简便、检测周期短将在未来取代多管发酵法、滤膜法等传统方法, 尤其是酶底物法采用密封培养技术。